Introducão
A aquisição de dados no modo SIM, em vez da verificação completa (full scan), oferece diversas vantagens em determinadas aplicações:
Geralmente fornece níveis de sensibilidade muito mais altos;
Oferece melhor desempenho quantitativo;
Permite-nos obter dados quantitativos de picos não resolvidos;
Permite-nos usar padrões internos rotulados isotopicamente.
Com este método nomeamos um íon quantificador no modo SIM e calculamos nossos resultados usando as áreas de pico no cromatograma gerado por esta relação m/z.
Existem vários desafios importantes no uso do SIM:
- Estamos monitorando apenas um único íon e não obtemos informações espectrais adicionais para fornecer confirmação qualitativa da identidade do pico;
- Existe o risco, particularmente em cromatogramas complexos, de que outras substâncias (íons de fundo ou compostos coeluentes) gerem íons com a mesma m/z do íon quantificador escolhido. Isso causa interferência e baixo desempenho quantitativo.
Com os íons qualificadores, identificamos vários outros íons no espectro do nosso composto alvo que acreditamos serem provavelmente específicos do nosso composto. Além da aquisição SIM de nosso íon quantificador, também adquirimos aquisições SIM de nossos íons qualificadores.
Se observarmos um pico no mesmo tempo de retenção em nosso quantificador e em todos os nossos cromatogramas SIM qualificadores, isso dá alguma garantia de que esse pico foi gerado pelo nosso analito alvo.
A confirmação da proporção de íons leva os íons qualificadores um passo adiante, especificando um limite na proporção de áreas de pico obtidas pelos íons qualificadores. Se a proporção das áreas dos picos corresponder à abundância relativa destes íons no espectro de massa, isso proporciona uma maior garantia qualitativa da identidade e especificidade do pico utilizado para quantificação.
Íons qualificadores
A técnica de íon qualificador é onde nomeamos a aquisição SIM de outros íons no espectro de massa para nosso analito alvo. Esta é uma técnica qualitativa utilizada para fornecer garantia adicional de confirmação da identidade de um pico cromatográfico.
O espectro de massa deve conter vários íons (normalmente um mínimo de 3) derivados do composto alvo. Isto normalmente significaria um espectro EI de GC-MS ou dissociação induzida por colisão (CID) em LC-MS.
Os sinais de íons podem ser obtidos a partir de múltiplas aquisições de SIM ou de sinais de íons extraídos de aquisição de varredura completa; no entanto, o SIM geralmente oferece níveis mais elevados de sensibilidade e melhores resultados quantitativos.
A escolha de quais íons usamos como qualificadores vem de um espectro de massa full scan de referência do nosso composto alvo. Este pode ser um espectro de referência, por exemplo, de uma biblioteca NIST ou de uma aquisição full scan do cromatograma de um padrão. Vejamos isso em ação com o espectro de massa do nonilato de metila (Figura 1).
Neste espectro, o pico base é o de relação m/z 74. Os próximos 3 íons m/z mais abundantes são:
m/z 87 (relative abundance 59%)
m/z 55 (relative abundance 25%)
m/z 141 (relative abundance 17%)
Se tivermos certeza de que esses íons eram específicos do composto nonilato de metila, poderíamos confirmar a identidade de um pico cromatográfico como nonilato de metila pela presença de um pico nos cromatogramas gerados em cada um desses sinais m/z.
A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos sugere uma faixa de +/- 20% aplicada às abundâncias relativas exigidas.
Falsos Positivos
Um falso positivo é obtido quando observamos esses íons e abundâncias relativas em um pico cromatográfico que não é nonilato de metila. Isso pode ocorrer quando temos uma substância semelhante ao nonilato de metila ou quando usamos íons que não são específicos em nossos critérios de qualificação.
Os falsos positivos podem ser minimizados garantindo a seleção de íons específicos para nosso composto alvo no espectro de referência.
Falsos Negativos
Um falso negativo é obtido quando não observamos todos os íons necessários ou as abundâncias relativas mostram uma correlação fraca com os valores de referência, mas o pico cromatográfico é na verdade nonilato de metila. Isso pode ocorrer quando temos uma substância contaminante co-eluída com nonilato de metila, que adiciona sinais m/z adicionais de alta abundância a um espectro de varredura completo ou quando a fonte de íons foi mal sintonizada ou contaminada.
Ion Ratio Confirmation (IRC)
A Confirmação da Razão de Íons (IRC) amplia a técnica de íons qualificadores para incluir um nível adicional de garantia na identidade do pico positivo e na especificidade quantitativa dos resultados de um cromatograma. Fazemos isso aplicando um limite à diferença relativa nas áreas obtidas entre nossos cromatogramas quantificador e qualificador.
Todos os métodos analíticos exigem especificidade – que os resultados quantitativos gerados estejam livres de qualquer tipo de interferência de compostos potencialmente contaminantes. Em certas aplicações existe o risco de um composto contaminante poder co-eluir com o nosso composto alvo. Devido à natureza do EI e ao alto grau de fragmentação que ele induz, existe o risco de que um composto coeluido possa gerar um íon fragmento idêntico ao íon SIM que estamos usando para quantificar (íon quantificador) nosso composto alvo. Isso produziria um erro significativo em nosso resultado.
Usando a técnica de confirmação da proporção de íons (IRC):
Dá um nível adicional de garantia de que um pico foi gerado pelo nosso composto alvo;
Alerta-nos quando um íon interferente está gerando um erro em nossos resultados quantitativos;
Permite-nos utilizar um sinal SIM alternativo, livre de interferências, para quantificar a nossa amostra.
Vejamos como isso funciona. A estrutura do diazepam é mostrada na Figura 2.
O espectro de massa EI para o diazepam é mostrado na Figura 3. Podemos usar um espectro obtido de uma biblioteca de referência, como o NIST, ou idealmente podemos adquirir um nosso próprio a partir da aquisição de uma solução de teste limpa (uma que não contém matriz ou outras substâncias potencialmente interferentes).
Digamos que vamos calcular nossos resultados quantitativos usando as áreas dos picos de um íon quantificador do íon SIM 283.
A Tabela 1 mostra os quatro íons mais abundantes e suas abundâncias absoluta e relativa do espectro de referência do diazepam.
Íon | Abundância m/z | Abundância Relativa (%) |
|---|---|---|
283,15 | 485.000 | 100% |
256,08 | 368.000 | 75,88% |
221,15 | 139.000 | 28,66% |
110,15 | 67.800 | 13,98% |
Tabela 1: Quatro íons e abundâncias mais abundantes para o espectro de referência do diazepam.
Se adquirissemos cromatogramas SIM para cada um desses quatro íons, esperaríamos que as áreas relativas dos picos de cada cromatograma refletissem as abundâncias relativas na Tabela 1. Vejamos os dados cromatográficos que obtemos para um pico puro de diazepam adquirido pelo SIM para cada uma dessas quatro massas (Figura 4 e 5, Tabela 2).
O que vemos é que as áreas relativas de cada um dos cromatogramas e as abundâncias relativas entre os íons no espectro de massa apresentam uma correlação muito boa (Tabela 2). Isto nos daria confiança de que os sinais para todos esses íons foram gerados apenas a partir do diazepam e que nosso cromatograma SIM obtido a partir de nosso íon quantificador de 283 fornecerá resultados específicos livres de interferência.
Espectro de Massas | Cromatograma |
Íon | Abundância m/z | Abundância Relativa (%) | Área do Pico | Área do Pico Relativa (%) |
|---|---|---|---|---|
283,15 | 485.000 | 100% | 1.279.401 | 100% |
256,08 | 368.000 | 75,88% | 971.685 | 75,95% |
221,15 | 139.000 | 28,66% | 366.499 | 28,65% |
110,15 | 67.800 | 13,98% | 179.034 | 13,99% |
Tabela 2: Comparação da abundância relativa do espectro de massa com as áreas dos picos cromatográficos.
Se tivéssemos uma substância coeluente presente no cromatograma que gerasse um íon de 283 amu, nossa área de pico SIM 283 (quantificador) seria maior devido ao sinal ser uma combinação de 283 do diazepam e 283 do nosso composto interferente. As áreas relativas percentuais para todos os outros íons SIM seriam agora diferentes das abundâncias relativas no espectro de referência. Isto indicar-nos-ia claramente que estávamos a sofrer interferência no nosso quantificador em 283.
Para a técnica típica de íons qualificadores usada em relatórios de dados, normalmente definiríamos um limite percentual (por exemplo, +/- 10%) em torno de cada área relativa do qualificador.
A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos sugere uma faixa de +/- 20% aplicada às abundâncias relativas exigidas.
E se tivermos interferência?
Vamos considerar uma situação em que as áreas relativas do nosso qualificador são diferentes dos nossos valores de referência esperados. Isto indica que pelo menos um íon está sujeito à interferência de um íon contaminante. Ainda poderá ser possível gerar resultados aceitáveis, desde que:
Pode confirmar qual íon está sujeito a interferência;
Que outro par de íons mostre áreas relativas aceitáveis para valores de referência.
Neste caso, usamos quatro íons e baseamos nossos valores de referência nas abundâncias relativas desses íons em relação ao nosso íon quantificador de 283. Usando nosso íon 256 como exemplo, o cálculo que usamos foi:
Abundance (256)/Abundance (283) x 100
(368,000/485,000) x 100 = 75.88%
Agora precisamos de levar os nossos dados um passo adiante, calculando as áreas relativas entre pares de íons. Podemos produzir os seguintes dados pegando o sinal menor, dividindo pelo sinal maior e multiplicando por 100%.
256 / 221 = 37,77%
256 / 110 = 18,42%
221 / 110 = 48,78%
Se tivermos um contaminante coeluido que emita um sinal em 283, nossa área de pico aumentará, digamos, para 500.000. Isso então fornece as áreas relativas na Tabela 3.
Espectro de massas | Cromatograma |
Íon | Área do pico | Área do Pico Relativa (%) |
|---|---|---|
283,15 | 500.000 | 100 |
256,08 | 368.000 | 73,60 |
221,15 | 139.000 | 27,80 |
110,15 | 67.800 | 13,56 |
Tabela 3: Comparação da abundância relativa do espectro de massa com áreas de pico cromatográfico.
Como todas as razões de área são calculadas em relação ao nosso quantificador de 283 e todas as razões de área estão mostrando erro, isso indica que a contaminação está no íon 283. Podemos confirmar isso calculando as áreas relativas entre cada par de íons e vemos o seguinte :
256 / 221 = 37,77%
256 / 110 = 18,42%
221 / 110 = 48,78%
Estes são idênticos aos nossos valores de referência. Isto confirma que a interferência ocorre apenas em 283, confirma que os outros íons não estão sujeitos a interferência, e poderíamos nomear qualquer um desses íons como um íon quantificador alternativo para calcular resultados quantitativos com confiança.